您一定沒聽說過非洲豬瘟和恩諾沙星之間的關系

發布時間:2019-03-14 09:29:11   來源:飼料技術匯   閱讀:24886次

喹喏酮類藥物對非洲豬瘟的體外抗病毒活性研究

摘要

非洲豬瘟是一種病毒性疾病,目前尚無有效的疫苗和治療方法。通過對30種喹喏酮類藥物對非洲豬瘟病毒(ASFV)感染的抗病毒作用體外篩選,發現從感染早期開始,暴露于其中6種喹喏酮類藥物(恩諾沙星,格列沙星,巴洛沙星,妥舒沙星,加替沙星,加雷沙星)或他們的一些組合時,ASFV感染的Vero細胞的細胞病變效應嚴重降低。此外,經過藥物7天的處理后,PCR檢測不到ASFV基因組,而且細胞培養上清液無法感染新的細胞。脈沖式凝膠電泳(PFGE)分析顯示,暴露于這些喹喏酮類藥物的細胞中,基因組碎片無法識別,病毒DNA復制減少,早期感染觀察到病毒蛋白合成模式發生改變。總體結果表明,細菌拓撲異構酶抑制劑(喹喏酮類藥物)可能通過某種靶向作用ASFV-拓撲異構酶Ⅱ來干擾ASFV的復制循環,為抗病毒治療打開了新的窗口。

1 引言

非洲豬瘟(ASF)是養豬業中最具威脅的疾病之一。它在大多數撒哈拉以南非洲國家流行,2007年經格魯尼亞重新傳入歐洲大陸。從那時起,它開始蔓延到周邊國家,極大地改變了歐洲的非洲豬瘟形勢。除了受鄰近國家的影響外,歐盟面臨著引入非洲豬瘟的嚴重危險。由于缺乏協調的控制計劃,缺少生物安全措施,以及傳統上使用泔水喂養,俄羅斯聯邦及其鄰近地區對ASF的控制一直受到阻礙。在這種情況下,東歐的ASF的情況會讓ASF進入歐盟的風險不斷增加,尤其是那些難以控制的路線,如野豬的活動、動物和動物產品、受污染的車輛或其他污染物的非法轉運。盡管人們努力研發疫苗,但目前還沒有突破,對該病的控制依賴于早期診斷和實施包括撲殺在內的嚴格生物安全措施,同時這些措施對受影響的國家造成了嚴重的經濟和社會危害。非洲豬瘟其病原是非洲豬瘟病毒(ASFV),一種大型DNA病毒,是非洲豬瘟科的唯一成員。ASFV編碼一種拓撲異構Ⅱ型酶,這是哺乳動物感染病毒的一個獨特特征。系統發育學研究表明,ASFV-拓撲異構酶Ⅱ不與宿主細胞Ⅱ型拓撲異構酶發生分支,與細菌DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ具有約25%的整體同源性,這增加了使用抗菌拓撲異構酶抑制劑(如喹喏酮類)干擾ASFV復制的可能性。

喹喏酮類化合物通過捕獲DNA上的DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ,促進藥物-酶-DNA裂解復合物的形成,從而表現出強大的抗菌活性。藥物-酶-DNA裂解復合物誘導DNA復制的破壞,并觸發細胞死亡機制(如氧化應激和基因組破碎)。DNA促旋酶負責在復制叉前減輕扭轉應力,拓撲異構酶Ⅳ則顯示了對基因組拆開的有效能力。

最近的研究表明,氟喹諾酮分子結構的化學修飾導致了它們對RNA和DNA病毒新的“非經典”抗病毒特性。考慮到ASFV編碼一種拓撲異構酶Ⅱ,我們旨在通過Ba71V分離物感染Vero細胞培養,分析這些抗生素對ASFV-DNA復制和病毒蛋白合成的潛在抑制活性。鑒于目前還沒有針對ASF的疫苗和治療方法,發現新的抗病毒藥物并將其應用于疫情中心附近農場的豬只,從而在疫情周圍建立一個安全圈,這對于控制感染的傳播和給當局實施應對措施的時間可能非常有用。

2材料與方法

2.1 細胞培養和病毒傳播

Vero E6細胞來自ECACC,保存在DMEM中,添加10%熱滅活犢牛血清、2m ML谷氨酰胺和非必需氨基酸(均來自Gibco公司),細胞保存在37℃、5%二氧化碳濃度、>90%濕度的培養箱中培養。如前所述,ASFV-Ba71V分離物通過在Vero細胞上的菌斑試驗進行繁殖和滴定。

2.2 病毒感染和藥物治療

采用DMEM培養基將亞融合Vero細胞在6孔板上培養至每cm2約5萬個細胞,并以0.1倍(MOI=0.1)的倍數感染ASFV-Ba71V。病毒吸附1小時后,取出接種物,用DMEM洗滌細胞2次。感染4小時后,ASFV感染的Vero細胞從第一代至第四代暴露于30個喹喏酮類藥物,分別是:萘啶酸,氟甲喹,環丙沙星,依諾沙星,氟羅沙星,洛美沙星,那氟沙星,氧氟沙星,諾氟沙星,巴洛沙星,格雷沙星,左氧氟沙星,帕珠沙星,司帕沙星,托氟沙星,貝西沙星,克林沙星,加雷沙星,吉米沙星,莫西沙星,加替沙星,西他沙星,達氟沙星,二氟沙星,恩諾沙星,馬波沙星,奧比沙星,普多沙星,沙氟沙星和新生霉素,分別是以下濃度500、400、300、200、100、75、50、25、10、5和1 ug/ml。所有藥物均購自Sigma公司和安徽五礦開發有限公司,以1 mg/ml (0.1 M PBS/NaOH)的原液配制。培養7天,每24小時更換含抗生素培養基。每天用藥物原液稀釋(10 mg/ml, 0.1 M PBS/NaOH稀釋),制備工作溶液。除了感染細胞外,還包括使用暴露于最高濃度氫氧化鈉稀釋劑的感染細胞的作為對照。預防試驗在ASFV感染前2小時添加抗生素,7天內每24小時補充一次。

2.3 PCR檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)DNA

使用通過本課題組前期所述的A238L編碼區的引物,進行PCR擴增檢測病毒DNA (Gilet al., 2003),病毒DNA從感染的Vero細胞中提取,該Vero細胞未經過氟喹諾酮類藥物商業試劑盒治療處理,提取步驟完成后,將1 ul DNA轉移到含有2.5 ul Taq緩沖液(10×)、1 ul MgCl2 (25 uM)、0.5 ul dNTP’s (10 uM)、15.3 ul ddH2O、0.2 ul Taq、0.25 ul各引物(100 uM)、正向(5’- GGCCGTACTTCAAATGTGCT-3’)和反向(5’- CCAGTCCCAAGCAGTAAAGC -3’)的PCR 混合液中,共25 ul。PCR反應如下:94℃2分鐘,95℃變性30秒,42℃退火30秒,72℃擴展1分鐘,最后72℃擴展10分鐘。以2%的溴化乙錠瓊脂糖凝膠為載體,在紫外光下觀察擴增產物(預測720bp)。7天后,用培養上清液感染新的Vero細胞培養,重復上述步驟。

2.4 脈沖式凝膠電泳(PFGE)

Ba71V分離物分別以MOI為0.1、1和5感染Vero細胞,并在感染16小時后收集,經胰蛋白酶處理之后,將4×105個細胞包埋在低熔點瓊脂糖塞子中,并且在固定之后,將來自每個實驗組的塞子轉移到含有2ml裂解緩沖液(125 mM EDTA, pH 8.0,1.2% SDS和蛋白酶K)的試管中50℃24小時,然后在24小時內用Tris-EDTA緩沖液(10mM Tris-HCl, pH 7.6和50mM EDTA, pH 8.0)對塞子進行清洗,將總DNA包埋在塞子中,在1%瓊脂糖凝膠、0.5 ×Tris-Borate-EDTA緩沖液(45 mM Tris-HCl, 45 mM 硼酸, 1mM EDTA)中凝膠電泳。分離在CHEF DR II設備上進行,120度場角,8-30 s開關時間,6 V/cm, 14 ℃ 24小時,緩沖溫度是用冰浴進行維持,采用低量程DNA階梯作為大小標記(PFG Marker)。電泳后,用溴化乙錠染色4小時,在紫外線透照器下拍照。

2.5蛋白提取與Western blot分析

藥物處理后,細胞生長在30mm培養皿中,之后對照感染組細胞和ASFV(非洲豬瘟病毒)感染組細胞在改良的RIPA緩沖液中溶解。全細胞溶解物在病毒感染6小時和32小時后制備,首先進行SDS-page凝膠電泳,后轉膜到0.2毫米孔徑硝化纖維素膜上,blot膜首先用5%胎牛血清(加1%吐溫)封閉1小時,之后blot膜在加有特異性抗體的PBST溶液中孵育1 h。之后blot膜用PBST溶液洗滌三次,每次10分鐘,之后用辣根過氧化物酶結合的二抗孵育30分鐘,之后轉膜蛋白用增強化學發光檢測系統檢測,根據廠家說明書(LuminataTM Crescendo, Millipore公司產品)。

2.6免疫印跡抗體和免疫熒光抗體分析

兔單克隆抗體抗a-微管蛋白(11H10株)由Cell Signalling Technology, Boston, USA提供,非洲豬瘟抗血清由Benedita Cruz,LNIV, Lisbon惠贈。辣根過氧化物二抗由Jackson ImmunoResearch Lab提供。過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(ref.111-035-003)和過氧化物酶標記的山羊抗豬IgG(ref.114-035-003)由West Grove, USA提供。免疫熒光實驗使用了德州紅標記的兔抗豬抗體作為二抗。防熒光猝滅使用DAPI(Vector Laboratories提供)做為介質。為了防止熒光染料褪色,我們小心地處理了載玻片并保持在黑暗潮濕的房間期間抗體孵化項目。免疫熒光實驗使用熒光顯微鏡(型號為Leica DM R HC model)進行分析。數據由Photoshop CS5 軟件處理,照片由ImageJ open source 軟件處理。

2.7細胞活性實驗

MTS實驗(一種測定細胞增殖的方法)用于測定氟喹諾酮類藥物對細胞的毒性,1 x103細胞培養在96孔細胞版,之后細胞分別暴露在100μg/ml,50μg/ml, 25μg/ml藥物濃度下,為了確定背景值,3個孔只加藥物溶液作為對照,孔中無細胞培養。7天過后,細胞培養皿中棄掉90μl的培養液,加上90μl的新鮮培養液和10μl的MTS。細胞在37 °C繼續培養2小時。之后細胞中加入終止液,15分鐘后輕攪孵育,在吸光度490 nm下,使用微型板閱讀器讀取數據。細胞活力由測定的值減去背景平均值得到。

3結果

3.1加入特定氟喹諾酮類藥物后,感染非洲豬瘟病毒的細胞病變減弱

Vero細胞感染非洲豬瘟病毒后,會發生細胞病變,死亡和凋亡(Knudsen et al., 1987)。我們在ASFV感染Vero細胞中通過細胞病變來評估30種氟喹諾酮類藥物抗病毒的效果。小部分篩選的氟喹諾酮類(恩諾沙星,格列沙星,巴洛沙星,妥舒沙星,加替沙星,加雷沙星)發現具有抗病毒活性,在100μg/ml濃度下。圖Fig. 1A, a顯示asfv病毒感染4小時后,加入這些氟喹諾酮類,經過7天的培養,僅出現輕微或者無細胞病變CPE。圖Fig. 1A, b顯示無氟喹諾酮類藥物處理,感染72小時后Vero細胞出現嚴重細胞病變。圖Fig. 1A, c為未感染ASFV的細胞,無細胞病變,圖Fig. 1A, d顯示感染的細胞出現細胞崩解,細胞核斷裂,而不是細胞病變。然而,大部分單層細胞維持著未經處理的典型成纖維細胞樣形態,而未經藥物處理的細胞在感染12小時以后出現清晰的細胞病變,細胞質/細胞核值減少。

圖:A a.用100ug/ml恩諾沙星處理細胞,感染非洲豬瘟病毒7天后后,觀察到輕微的細胞病變或無細胞病變, b.細胞感染非洲豬瘟病毒后,未用恩諾殺星處理,72小時后出現嚴重的細胞病變

c.細胞未感染非洲豬瘟病毒d.細胞感染非洲豬瘟病毒后,經恩諾沙星處理后,可以看到細胞形態凋亡,細胞核崩解。

B用免疫熒光對比藥物處理的細胞a和非洲豬瘟病毒感染的細胞b ,可以看到非洲豬瘟病毒感染12小時后,細胞出現病變,細胞變圓,非洲豬瘟病毒染色衰減(紅色),而用藥物處理的細胞,未出現細胞病變。藍色為細胞核的顏色。為了解釋本圖圖例中的顏色參考,讀者可參考 文章的Web版本。)

3.2暴露于氟喹諾酮類藥物后破環了ASFV感染

為了研究氟喹諾酮類藥物對非洲豬瘟病毒的抑制,我們用PCR的方法檢測非洲豬瘟病毒DNA片段,A238L,大約720bp。在100ug/ml的藥物濃度處理下,在感染早期(即感染4小時后),可以看到非洲豬瘟病毒片段A238L顯著減少甚至檢測不到。在多種篩選的氟喹諾酮類藥物中,如圖Fig. 2A, lanes 3–29,藥物濃度越高(50, 75 到 100 ug/ml),A238L越難檢測到,呈現劑量依賴。同時,圖(Fig. 2A, lanes32–57可以看到兩種氟喹諾酮類藥物(25 + 25 ug/ml 和 50 + 50 ug/ml)或3種氟喹諾酮類藥物(15 + 15 + 15 ug/ml 和 25 + 25 + 25 ug/ml)聯合應用時,能夠增強對非洲豬瘟病毒復制的抑制。圖Fig. 2B, lanes 5, 11, 14, 17,23 and 26顯示從經過7天的治療后ASFV感染的Vero獲得的上清液,重新對非洲豬瘟病毒核酸陰性細胞感染7天,通過細胞毒性CPE觀察和PCR鑒定,新細胞沒有感染。表1總結了一種或多種氟喹諾酮類藥物對非洲豬瘟病毒復制的影響,通過PCR檢測。

圖2所示:(A)氟喹諾酮類藥物可抑制A238L病毒基因擴增。在暴露于選定的單/雙/三種抗生素組合時,A238L擴增產物在ASFV感染細胞中減少或缺失。6種氟喹諾酮類藥物在100 mg/ml時無病毒DNA擴增( 5, 11, 14, 17, 23和26),隨后在(25 + 25 mg/ml和50 + 50 mg/ml)和三種組合(15 + 15 + 15 mg/ml和25 + 25 + 25 mg/ml) 時(32-57),一些氟喹諾酮聯合暴露可導致A238L病毒基因擴增信號降低(32-43)。以模擬感染的Vero細胞和未處理的ASFV感染細胞分別作為陰性對照(1,30)和陽性對照(2,31)。在高濃度抗生素作用下,氯氟沙星(7-9)、司帕沙星(19-21)和克林沙星(28-30)的抑制作用也降低了。凝膠圖像左側為A238L特異性基因大小。(B) 經過7天的無藥期后,氟喹諾酮類藥物對A238L基因擴增的抑制作用仍持續存在。氟喹諾酮治療后經過7天的無藥期A238L擴增的細胞培養均為陰性 (如5、11、14、17、23和26)。以模擬感染的Vero細胞和未處理的ASFV感染細胞分別作為陰性對照( 1,30)和陽性對照(2,31)。凝膠圖像左側為A238L特異性基因大小。

當vero感染細胞暴露于特定的氟喹諾酮混合物時(25 + 25mg/ml和50 + 50mg/ml和三種組合:15 + 15 + 15 mg/ml和25 + 25 + 25 mg/ml)(圖2A, 32-57),發現對病毒DNA復制有顯著影響。經過7天的治療,從感染ASFV的Vero細胞中提取上清液,進行ASFV DNA PCR擴增呈陰性,并且無CPE效應、沒有感染新的細胞。(圖2B,5、11、14、17、23和26)。表1總結了通過單個和氟喹諾酮聯合使用,可充分抑制ASFV復制。

3.3 氟喹諾酮類藥物可抑制ASFV DNA的基因組碎片復制

氟喹諾酮類藥物的殺菌機理是促進藥物-拓撲異構酶-DNA裂解復合物的形成(Fa`bregaet al .,2009)。因此,我們的目標是驗證這些裂解復合物在ASFV病毒DNA上的形成。正如預期的那樣,隨著ASFV MOI(0.1, 1, 5)的增加從受感染的Vero細胞中獲得DNA塞子,表現為全長病毒基因組的擴增數目(線性帶170kb),以及不完整的病毒基因組24 hpi(圖3,4-6)。 從先前暴露于恩諾沙星的受感染細胞中獲得的DNA探針顯示,完整和不完整的病毒基因組明顯減少。((圖3)當最高濃度使用(100 mg/ml)更加顯著(圖3,第12-14道瓊脂)。探針塞來自模擬感染細胞(0和24hpi)(圖3,泳道1和2 )未顯示病毒基因組含量。此外,探針從暴露于依托泊苷的ASFV感染細(MOI=5),一個,特異性宿主細胞拓撲異構酶Ⅱ型毒物(1 mM)未顯示碎片基因組的增加物種,提示II型宿主拓撲異構酶不,切割asfv病毒基因組(圖3,泳道3)。未檢測ASFV細胞基因組碎片在暴露于a氟喹諾酮藥物后(圖3,第7欄 and 11),和11欄),證實了從MTS獲得的細胞毒性試驗結果。

采用Western blot技術比較分析暴露于氟喹諾酮類和沒有暴露于氟喹諾酮類of viral protein synthesis between ASFV-infected Vero cellsASFV感染Vero細胞間病毒蛋白合成exposed and non-exposed to fluoroquinolones. Since early。結果顯示從早期開始phase of infection (6 hpi), the viral protein expression in感染階段(6hpi),氟喹諾酮暴露組的細胞病毒蛋白表達fluoroquinolone-exposed cells (Fig. 4A, lanes 3–14) was(圖4a,3-14道)不同于陽性對照組(圖4a,2道);in exposed-cells, a small viral protein with 17 kDa was在藥物暴露的細胞中僅僅在兩條道viral proteins (63 kDa and 20 kDa) were only detected僅檢測到病毒蛋白(63kDa和20kDa)。一個17kDa的小病毒蛋白only clearly identified in the non-treated infected control.僅在未經處理的感染控制中明確識別。At late phase of viral infection (32 hpi), viral proteins病毒感染后期(32hpi),病毒蛋白heavier than 50 kDa were only detected in the positive大于50kDa僅在陽性細胞中檢測到,control (Fig. 4B, lane 2) whereas infected treated cells still對照組(圖4b,第2道),而受感染的治療細胞仍然displayed high expression levels of 35 kDa viral protein顯示了35kDa高表達水平病毒蛋白和and low levels of 17 kDa viral protein (Fig. 4B, lanes 3–低水平的17kDa病毒蛋白(圖4b,3- 14)。

在7天的暴露期后,6種fluoroquinolones induced a cellular growth inhibition,氟喹諾酮類藥物誘導細胞生長抑制,使用100 mg/ml濃度下進行MTS分析,MTS assay. The reduction observed ranged from 40% with測定結果顯示恩諾沙星生長減少15%,巴洛沙星減少40%(圖5)。所有兩種或三種兩種或氟喹諾酮的組合使用中,顯示與單種使用相比,細胞毒性更低。


圖5

4討論

非洲豬瘟病毒科、綠藻病毒科、彩虹病毒科是已知的通過編碼拓撲異構酶Ⅱ(DNA病毒復制中關鍵的酶)來感染真核細胞的病毒屬。

此外,感染非洲豬瘟病毒的Vero細胞中在上述提到的單種抗生素100 ug/ml濃度作用7天后,PCR檢測不到病毒ASFV的A238L基因。 當受感染的細胞暴露于氟喹諾酮聯合治療(兩種藥物50/50 ug/ml,三種藥物25/25/25 ug/ml),觀察到類似單一氟喹諾酮類作用的結果。此外,藥物處理過的感染后細胞上清液和未感染的新細胞培養物一樣,7天潛伏期后非洲豬瘟病毒DNA呈陰性, 無細胞病變效應。

這些試驗結果支持上述觀點:氟喹諾酮類藥物對非洲豬瘟病毒體外的感染有抑制作用,盡管病毒出現完全抑制作用只在早期加入氟喹諾酮類的試驗中觀察到,這也暗示著病毒復制酶的活性峰值可能出現在感染的早期。

正如在細菌中的作用一樣,氟喹諾酮類與DNA回旋酶和/或拓撲異構酶IV結合相互作用DNA復合物導致復制進程受阻,從而抑細菌DNA、RNA和蛋白質合成,導致快速細菌細胞死亡(Drlica和Malik,2003;Malik等人,2007年、2010年)。我們使用PFEG技術研究發現暴露于所選氟喹諾酮類藥物的感染細胞中的完整和不完整的病毒基因組基因均明顯降低。但沒有觀察到病毒破裂后DNA碎片。這些研究結果或許可以證明氟喹諾酮類藥物通過不同的機制對非洲豬瘟病毒產生作用。像其他人研究者指出的那樣,PFEG可以檢測高達250kb的小DNA片段(Birren和Lai,1994年)。因為喹諾酮類治療可以影響細菌染色體DNA片段(例如金黃色葡萄球菌中30 kbp或大腸桿菌中的100 kbp) ,這些藥物對ASFV的影響似乎與病毒染色體分裂無關。因此,氟喹諾酮類應作為ASFV拓撲異構酶II可逆抑制劑,與細菌中描述的作用機制相反。可能氟喹諾酮類藥物會對ASFV拓撲異構酶的鏈轉移活性干擾從而影響其ATP酶活性,通過抑制 ATP水解的最后一步會阻斷DNA復制。兩種抑制機制在復制叉前產生的扭轉\復制壓力,雖然沒有導致基因組斷裂但導致病毒DNA以及病毒蛋白的減少 。

同樣值得注意的是,與未處理的ASFV感染細胞相比。暴露于依托泊苷(一種特定宿主細胞拓撲異構酶II抑制劑)的ASFV感染的細胞中完整/不完整的ASFV基因片段未顯示明顯下降。這一結果有力地表明了宿主拓撲異構酶II不經常參與病毒基因組復制,提示這種宿主酶ASFV所用。

關于病毒蛋白合成,免疫印跡分析顯示在感染的早期(6 hpi)和晚期(32 hpi)ASFV感染的Vero細胞,未處理和處理之間出現嚴重差異。在細菌和真核細胞中報道(Baldwin和Osheroff,2005;Drlica等人,2008;Malik等人,2010)病毒蛋白合成的延遲是因為ASFV基因組的拓撲復雜性,減少了新的病毒基因組數量,從而影響病毒/宿主轉錄過程,損害病毒蛋白質翻譯(Baldwin和Osheroff,2005;Drlica等人,2008年;Malik等人,2010年)。

在缺乏抗ASF疫苗的情況下,早期診斷以及實施嚴格的生物安全措施,包括淘汰撲殺是消除其傳播唯一的戰略。抗病毒治療在ASF的爆發周邊地區的應用,可以在一定程度上控制疾病。該試驗證明了識別和鑒定抗病毒藥物分子這一努力是正確的。有可能代表未來ASF的替代控制方法 。

我們的研究結果表明,6種氟喹諾酮類藥物具有很強的抗ASFV作用。因此,這些藥物分子被認為是可能治療ASFV感染的潛在工具,當然進一步的研究這些藥物在體內效果是十分必要的。

5基金

這項研究通過項目PTDC/CVT/105630/2008和兩個博士獎學金(SFRH/BD/72872/2010 and SFRH/BD/65532/2009).

2010和SFRH/BD/65532/2009)得到了‘Fundacao para a Cienciae Tecnologia’基金的支持。

6利益沖突

作者聲明對當前手稿沒有利益沖突 。

*文章來源:In vitro antiviral activity of fluoroquinolones against African swine fever virus;2013年發表在Veterinary Microbiology雜志,影響因子IF:3.127




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本文來源:飼料技術匯

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更新日期:2019-05-07
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